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聚合酶链式反应

日期:2021-07-21浏览:262次

简介

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR的发明者凯利·穆利斯(Kary.B.Mullis)于1993年与迈克尔·史密斯分享了诺贝尔化学奖。

PCR反应过程

聚合酶链反应是在一个反应混合物中进行的,该反应混合物包括DNA提取(模板DNA)Taq聚合酶、引物,以及在缓冲溶液中过量的四种脱氧核糖核酸苷三磷酸盐(dNTPs)PCR的三步骤为变性---退火---延伸。

模板DNA的变性:模板DNA经加热至94左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;

模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

引物的延伸:DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的半保留复制链",而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟, 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

临床应用

PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上,只要样本有一个病原体存在,PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~100基因拷贝,而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的窗口期"问题,可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。此次武汉新型肺炎中核酸检测"所使用到的就是基于PCR法的实时荧光定量PCRreal-time PCR)技术。

在许多肿瘤早期和良性的阶段,癌基因的表达改变以及突变就已经出现,PCR技术不但能有效的检测基因的突变,而且能准确检测癌基因的表达量,可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。而在肿瘤的个体化用药中,《个体化医学检测质量保证指南》中提到的几大类检测方法中,如Sanger测序法、焦磷酸测序法、NGSARMS-PCR法、HRM法,数字PCR法,荧光定量PCR法都是基于PCR法发展的新型技术。

在遗传病方面,PCR技术的临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。

PCR是一种现在在细胞和分子生物学中使用普遍的技术。它允许,特别是在几个小时内,通过自动化系统非细胞克隆"DNA片段,这通常需要几天的标准技术的分子克隆。另一方面,PCR被广泛用于诊断目的,以检测特定的DNA序列的存在这个或那个生物体在生物液体。它还被用来制作遗传指纹,无论是在司法调查中对一个人的遗传鉴定,还是对动物品种、植物或微生物进行食品质量检测、诊断或品种选择的鉴定。PCR仍然是进行测序或定点突变所必需的。另外还有一些关于PCR技术改良的报道例如金属有机框架辅助的高效聚合酶链式反应。

PCR变体

最后简单介绍一下PCR的变体,如real-time PCR, competitive PCR, PCR in - situ, RT-PCR等。

递减PCRtouchdown PCR):前几循环温度逐渐下降。

逆转录PCRRT-PCR):以由mRNA逆转录而来的cDNA为模板,也因为是从表现型基因来进行增量的,由此产生出来的cDNA产物不带有内含子(基因中不具意义的段落),常应用于分子克隆技术。

热启动PCRhot start PCR):以高热激活型核酸聚合酶进行反应,减少非专一性产物。

实时荧光定量PCRreal-time PCR):PCR过程中利用萤光探针或染料定量检测,又称定量PCRquantitative PCR),可以进行多组对比。此次武汉新型肺炎中核酸检测"所使用到的关键技术

巢式PCRnested PCR):先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量,再用高特异性引物扩增。

多重PCRmultiplex PCR):在同一个管中使用多组引物。

复原条件PCRreconditioning PCR):PCR产物稀释10倍后重新放入原浓度的引物和dNTP等循环3次,以消除产物中的异二聚体。

dsRNA合成(dsRNA replicator):合并使用high-fidelity DNA polymersaeT7RNA聚合酶与Phi6 RNA replicase;从双股DNA转录为对应的双股RNAdsRNA)。可应用于RNAi实验操作。

COLD-PCR(co-amplification at lower denaturation temperature-PCR):用以检测突变或特殊等位基因的PCR应用技术。

Digital-PCR:将标准的PCR反应分割至每一个反应中仅1~2copy。藉以侦测微小比例的基因差异。应用于:病原体检测、癌症突变基因、借由母血对胎儿做产前检测。

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