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逆转录PCR

日期:2021-07-26浏览:190次

RT-PCR,逆转录PCR或称反转录PCRReverse Transcription PCR),是聚合酶链式反应的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,RNA在逆转录酶的作用下被逆转录成为互补DNAcomplementary DNAcDNA),再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

基本原理:

用逆转录酶以RNA为模板合成与其互补的DNAcDNA)的过程。因为mRNA末端存在Poly A,所以用Oligo dT作为通用引物与其互补。商品化的反转录试剂盒里通常除了Oligo dT之外,还可以用随机引物,但一般用Oligo dT引物就可以了。

 

重要参数:

不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同;因此,适合于一种mRNA拷贝的条件可能对另一种mRNA不适合。一般来说,从事不均一mRMA群体时,所使用的条件是导致cDNA合成的终产量达到最大,下述参数十分重要。

1、逆转录酶: 有两种不同的逆转录酶可以催化以mRNA为模板,oligo(dT)作为引物,合成与mRNA互补的cDNA链。一种来自纯化的 AMV,由两条肽链组成,具有聚合酶活性和很强的RNAH活性,它最适温度是42℃,最适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍,然而高水平的RNAH的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。另外,禽源逆转录酶制剂可被能切割DNA的核酸内切酶污染。

另一种是Mo-MLV,是单肽链的,有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNAH活性,最适温度37℃,最适pH7.6,较弱的RNAH活性对获得2-3kbmRNA的全长cDNA有很大好处。在第一链反应前可用氢氧化甲基汞处理,破坏mRNA的二级结构,这一步对于最适反应温度较低(37)℃的鼠源逆转录酶催化的反应可能更为重要。临合成cDNA第一链之前加入过量的巯基试剂,可以使氢氧化甲基汞从RNA上解离。

2、单价阳离子: 离子条件基本上影响各种模板的转录效率。用钾比用钠离子可获得较长的转录产物。对于cDNA长度的最适钾离子浓度为140-150mM

3、二价阳离子: 对于反转录酶活性来说,二价阳离子是必需的。低于4mM Mg2 未能观察到活性;产生全长转录产物的最适浓度是6-10mM

4、脱氧核苷三磷酸: 使用四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)中每一种的高浓度对于有效合成cDNA是特别重要的。如果其中只有一种的浓度下降到10-50微摩尔以下,全长转录物的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-250微摩尔。

 

注意事项:

1RNA 提取一定要迅速,样本要新鲜,组织尽量在液氮中研磨;

2RNA 提取完马上进行逆转录不要拖延,新提的RNA很容易降解;

3、逆转录反应过程,需建立无RNAase环境,以避免模板RNA降解。

 


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