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Western blot之蛋白转印二三事

日期:2021-08-02浏览:249次

蛋白转印的方法

      蛋白转印可选择传统湿转、半干转或快速半干转方法。湿转系统:适用于大多数各种分子量的常规蛋白转印。转印过程中凝胶和膜被浸入充满转印缓冲液的槽中。半干转系统:凝胶和膜被夹在预先润湿缓冲液的滤纸之间,滤纸与平板电极直接接触。半干转系统的安装使用比湿转简单。快速转印系统:快速转印系统是最近发展出来的技术,使用专用设备、专用滤纸及专用缓冲液来快速有效地转印蛋白。通常滤纸和湿润的膜预先放在一次性包装中,简化了转印“三明治"的组装。

转印缓冲液

       转印缓冲液包含强导电性化学缓冲试剂(例如Tris,CAPS或碳酸盐),以便在转印过程中保持系统的电导率和pH值。另外,转印缓冲液中也有可能含醇(甲醇或乙醇)以促进蛋白与膜的结合,同时也可以添加SDS促进蛋白从凝胶中洗脱。

      SDS和醇:SDS和醇在转移中起相反的作用。SDS可以促进蛋白质从凝胶中洗脱,如果某些蛋白质难以从凝胶中洗脱,则可以将SDS添加到转印缓冲液中。但是,转印缓冲液中的SDS会降低蛋白质与硝酸纤维素膜的结合效率;如果需要,可以使用PVDF膜作为替代。醇可从SDS-蛋白质复合物中除去SDS,并改善蛋白质与硝酸纤维素膜的结合。但是醇会导致凝胶孔径减小,影响蛋白迁移;还会导致某些蛋白或碱性蛋白沉淀,还会使碱性蛋白带正电荷或处于中性状态

         转印缓冲液技巧:1、请勿重复使用转印缓冲液,因为在转印过程中缓冲液可能会失去保持稳定pH的能力。2、不要稀释转印缓冲液;这也会减少缓冲能力。3、请勿调节转移缓冲液的pH,因为这会增加缓冲液的电导率,产生较高的初始电流,降低电阻。

转印膜的种类

      转印膜有两类:硝化纤维素膜(NC)和聚偏二氟乙烯 (PVDF)。

      硝化纤维素膜和增强型硝化纤维素膜:硝酸纤维素膜很容易在水或转印缓冲液中润湿,并且与多种蛋白检测方法兼容。无支持的硝化纤维素很脆,不建议用于抗体剥离及重孵育实验。增强型硝酸纤维素膜是含有惰性支撑结构的硝酸纤维素膜。这种额外的支撑使膜具有更高的强度和弹性,可以用于抗体剥离及重孵育,并可承受高压灭菌(121℃),依然保持硝酸纤维素的易润湿性。

      聚偏二氟乙烯 (PVDF):PVDF 膜具有很强的蛋白结合能力(约为硝化纤维素的两倍),并且在通常的处理中不易破裂,因此可以用于抗体的剥离和重孵育实验。低荧光背景的 PVDF 膜结合了 PVDF 的优势,并且在很宽的波长范围内具有低自发荧光。在长时间曝光情况下,不会增加背景荧光水平,有利于检测微弱的荧光信号。

影响转印条件的因素

      缓冲液组成:添加SDS或其他的酸、碱液会引起离子浓度变化,从而改变转印系统的电阻,进而改变电流,并导致电流和电压读数以及转印效率变化。

      凝胶数:电流随着凝胶数量的增加而增加。需要考虑额外的冷却或限制转印时间。

      凝胶丙烯酰胺浓度:较高的丙烯酰胺百分比浓度会减慢蛋白在凝胶中的迁移。需考虑延长转印时间。蛋白质在低浓度丙烯酰胺凝胶中迁移速度快。应考虑限制转印时间,以防止小蛋白质转过。

      缓冲液量:缓冲液增加时电流也会增加。需考虑额外的冷却或限制转印时间。

      转印温度:电流随体系温度升高而增加。

      蛋白分子量:大蛋白从凝胶中迁移的速度更慢。考虑延长转印时间或增加电压。相反,小蛋白会快速迁移并可能穿透印迹膜。考虑限制转印时间或电压。

转印技巧

      1、去除气泡:均匀的蛋白质转印需要三明治的各组件之间完全接触,尤其是凝胶和膜完全接触。气泡会导致膜上出现空白点,蛋白转印时会在气泡周围“流动",因此请使用凝胶滚轮将这些气泡赶出!提示:梯度凝胶最好上下滚动,而不是左右滚动。左右滚动会导致梯度凝胶翘曲和起皱。

      2、转印前的预平衡:湿转和传统半干转时,将凝胶电泳缓冲液替换为转印缓冲液可获得更好的转印效果。电泳缓冲液的带入会增加电导率,从而导致转印过程中产生过多的热量。可在水中短暂冲洗凝胶,然后在转印缓冲液中平衡凝胶15分钟,平衡膜5分钟。请注意,对于某些快速转印系统,不建议使用凝胶预平衡,请遵循制造商的操作指南。

     3、防止膜变干:在转印之前和之后均需保证膜的湿润,从转印三明治中取出后,转印热量会使膜容易变干燥。对于PVDF膜尤其重要,因为PVDF膜是疏水的。应迅速将膜浸入预先准备好的缓冲液中,以免膜干燥。如果干了,可将硝酸纤维素膜重新在缓冲液中浸湿,而PVDF膜则需要在醇中重新活化。


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