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大肠杆菌感受态细胞的制备经验之谈

日期:2021-08-19浏览:329次

      细菌处于容易接受外源DNA的状态称之为感受态,通过物理或化学的方法,人工诱导细菌细胞成为敏感的感受态细胞是重组DNA转化细菌技术的关键。制备出感受态细胞,我们就可以方便的将需要克隆的质粒导入其中,使其繁殖,从而获得大量的质粒。CaCl2转化法是常用的感受态细胞制备方法,其制备流程简单,快捷,成本低,并且能够满足普通的转化和克隆的需求。

      判断感受态细胞制备的优劣主要是通过转化效率来检测。经转化外源质粒DNA的大肠杆菌在含抗性的LB平板过夜培养后,平板上长满克隆且阴性对照(未转入外源DNA的感受态)没有克隆,证明感受态细胞制备良好。


注意事项:

1、在制备感受态细胞过程中,所有用到的耗材,试剂均要求无菌,操作过程也要求完全按照无菌操作进行,避免杂菌及污染。

2、制备感受态的菌株最好是先将甘油菌划线于无抗性的LB平板中进行活化,然后挑选单克隆的液体培养基中培养。如果甘油菌溶解后直接在液体培养基中培养来制备感受态,会影响感受态细胞的活性。

3、在制备感受态细胞的过程中,保持各环节处于低温环境,4℃离心,冰上重悬,CaCl2溶液置于冰浴中,以保证感受态细胞的转化效率。

4、重悬细胞时,尽量避免吹打细胞造成细胞损伤,通过轻轻震荡使细胞重悬,减少对菌株的损伤从而影响其活性。

5、制备好的感受态细胞应尽快使用,存放过久会影响其转化效率。

6、感受态细胞不宜反复冻融,因为冻融过程中产生的冰晶会对细菌细胞造成伤害。




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