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细胞划痕实验新方法-----伤口愈合实验

日期:2022-04-18浏览:599次

伤口愈合实验的这个关键步骤,你掌握了吗?

 

伤口愈合实验是体外研究细胞迁移非常重要的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带,然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察;这些边缘的细胞会开始进行迁移活动,并且覆盖整个无细胞的区域,重新互相接触在一起。本研究中用到伤口愈合的实验,使用TARBP2和pri-miR130b共表达,通过对伤口愈合的速度的影响,得出TARBP2-K52R可以完全抑制pri-miR130b对伤口愈合过程的影响。

 

在文中,使用Ibidi的伤口愈合插件进行了伤口愈合实验。这是一种双孔的硅胶插件,可以放在培养皿中,插件两孔间的孔壁宽度为500μm。将细胞种在插件中,等待细胞贴壁长满后,将插件移除,这样,两孔间的缝隙就是一个无细胞的500μm“划痕"。

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                图1  使用ibidi Culture-Insert 2 Well进行伤口愈合测定的实验工作流程

 

1.实验材料

1) 细胞:    serum starved A549luc stable cell line

2) 实验耗材:   伤口愈合插件培养皿 (ibidi, 81176)

3) 细胞培养基:  DMEM   (Hyclone)

4) 试剂:  Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

5) 灭菌镊子

6)倒置显微镜,最好具有自动图像采集系统和用于活细胞成像的顶部培养箱

2.实验步骤

步骤1:铺细胞(图二)

1.将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。

2.在ibidi细胞插件的每孔中加入70μl 3x10 5的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。

3.将细胞在37°C和5%CO2下孵育至少24小时

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                  图2   A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.在ibidi伤口愈合插件中加入细胞。

 

步骤2:形成“划痕"

1.采用无血清DMEM培养基培养细胞24小时

2.如图三所示,小心的用镊子夹住插件的一个角,将插件移除。

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                                 图3   使用无菌镊子移除ibidi 插件

 

3.移除插件后,要用显微镜检查是否形成合格的“划痕"。

4.小心的用无细胞培养基或PBS清洗细胞,之后加入2ml培养基进行培养。


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                           图4   由ibidi插件移除产生无细胞500μm的缝隙

步骤3:采集显微图像分析

1.在显微镜下选取能同时看到“划痕"和两边细胞的视野进行成像,“划痕"的方向比较好是水平或者垂直。

2.采集0h和10h的图像,并且分析每张图的细胞覆盖划痕区的面积。


3.实验结果

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如图所示,共表达pri-miR130b和TARBP2-WT(miR130b-WT)比单独表达pri-miR130b(miR130b-con)对细胞迁移更有抑制作用,而将pri-miR130b和TARBP2-K52R(miR130b-K52R)共表达对于细胞迁移基本没有抑制作用了。


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