染色质免疫共沉淀（ChIP）

染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

实验流程：

甲醛处理细胞→收集细胞，超声破碎→加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合→加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀→对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合→洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物→解交联，纯化富集的DNA-片断→PCR分析。

具体操作：

第一天:

一、细胞的甲醛交联与超声破碎。

取出细胞，加入甲醛，使得甲醛的终浓度为1%。

37℃孵育10min。

终止交联。

吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中。预冷后离心收集细胞。

倒去上清。

超声破碎。

二、除杂及抗体孵育

超声破碎结束后，离心去除不溶物质。

在100μl的超声破碎产物中，加入900μl ChIP Dilution Bufer 和20μl × PIC。再各加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1h。

1h后，在4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min。

取上清。各留取20μl做为input。一管中加入1μl抗体，另一管中则不加抗体。4°C颠转过夜。

三、检验超声破碎的效果

取100μl超声破碎后产物，加入4μl 5M NaCl，65℃处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。

电泳检测超声效果。

第二天:

免疫复合物的沉淀及清洗

孵育过夜后，每管中加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转2h。

4℃静置10min后，离心除去上清。

清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液，在4℃颠转10min，4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min，

除去上清。

清洗完毕后，开始洗脱。

解交联:每管中加入20μl 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65℃解交联过夜。

第三天:

一、DNA样品的回收

解交联结束后，每管加入1μl RNAaseA(MBI) ，37℃孵育1h。

每管加入10μl 0.5M EDTA，20μl 1M Tris.HCl（pH6.5），2μl 10mg/ml蛋白酶K。45℃处理2h。

DNA片段的回收-omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100μl ddH2O。

二、PCR分析。

技术结合

CHIP-seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等相互作用的DNA区段信息。

染色质免疫共沉淀-芯片（ChIP-chip）：ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。ChIP-chip 技术的发展为分析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中，将对芯片的构建进行改进，提高其实用性。使用易于获得的抗体，增加这种方法的可用性。

技术应用

染色质免疫共沉淀技术主要应用于：组蛋白的修饰研究；染色质表观遗传修饰研究；转录调控分析；药物开发研究；有丝分裂研究；DNA损伤与凋亡分析等。

产品推荐：