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染色质免疫共沉淀(ChIP)

日期:2021-07-27浏览:285次

染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,ChIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;ChIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着ChIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

实验流程:

甲醛处理细胞→收集细胞,超声破碎→加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合→加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀→对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合→洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物→解交联,纯化富集的DNA-片断→PCR分析。

具体操作:

第一天:

一、细胞的甲醛交联与超声破碎。

取出细胞,加入甲醛,使得甲醛的终浓度为1%

37℃孵育10min

终止交联。

吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中。预冷后离心收集细胞。

倒去上清。

超声破碎。

二、除杂及抗体孵育

超声破碎结束后,离心去除不溶物质。

100μl的超声破碎产物中,加入900μl ChIP Dilution Bufer 20μl × PIC。再各加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA4℃颠转混匀1h

1h后,在4℃静置10min沉淀,700rpm离心1min

取上清。各留取20μl做为input。一管中加入1μl抗体,另一管中则不加抗体。4°C颠转过夜。

三、检验超声破碎的效果

100μl超声破碎后产物,加入4μl 5M NaCl65℃处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。

电泳检测超声效果。

第二天:

免疫复合物的沉淀及清洗

孵育过夜后,每管中加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA4℃颠转2h

4℃静置10min后,离心除去上清。

清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10min4℃静置10min沉淀,700rpm离心1min

除去上清。

清洗完毕后,开始洗脱。

解交联:每管中加入20μl 5M NaClNaCl终浓度为0.2M)。混匀,65℃解交联过夜。

第三天:

一、DNA样品的回收

解交联结束后,每管加入1μl RNAaseA(MBI) 37℃孵育1h

每管加入10μl 0.5M EDTA20μl 1M Tris.HClpH6.5),2μl 10mg/ml蛋白酶K45℃处理2h

DNA片段的回收-omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100μl ddH2O

二、PCR分析。

技术结合

CHIP-seq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等相互作用的DNA区段信息。

染色质免疫共沉淀-芯片(ChIP-chip):ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。ChIP-chip 技术的发展为分析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得的抗体,增加这种方法的可用性。

技术应用

染色质免疫共沉淀技术主要应用于:组蛋白的修饰研究;染色质表观遗传修饰研究;转录调控分析;药物开发研究;有丝分裂研究;DNA损伤与凋亡分析等。

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