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干货分享--WB实验问题总结与处理方案(一)

日期:2021-07-27浏览:460次

Western blot实验过程中常见问题汇总及处理方案。

 

1western blot 的优点及缺点

答: 优点:灵敏,特异性高,常规可达ng级,Ecl显色法理论上可达pg 级。

     缺点:通量有限。

 

2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白?

答: 原因有很多:首先排除WB过程是不是抗体的问题,重新实验、更换抗体;其次排除蛋白是否降解,提取的时候需要加入蛋白酶抑制剂, a) 你的细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;最后考虑此种细胞是否表达该蛋白,表达量高低。

 

3、提取液有的有沉淀,有的很清亮,为什么呢?

答: a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长, b) 也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。

 

4、蛋白质分子量很小(10KD),WB实验过程该注意哪些问题?

答:可以选择0.2μmPVDF膜,同时缩短转膜时间。

 

5、目的条带很弱,如何加强?

答:可以加大抗原上样量,这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。

 

6、胶片背景很脏,解决方法?

答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间,提高封闭时间。

 

7、目标带是空白,周围有背景,是为什么?

答:你的一抗浓度较高,二抗上HRP 催化活力太强,同时你的显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象"。将一抗和二抗浓度降低,或更换新底物。

 

8、我的胶片是一片空白,是怎么回事?

答:如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强,将底物消耗光;

b) ECM底物中H2O2,不稳定,失活;

c) ECL底物没覆盖到相应位置;

d) 二抗失活。

 

9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

答:a) 可能胶片被曝光了,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.b) 显影时间过长。

 

10DAB好还是ECM好?

答:DAB 有毒,但是比较灵敏,是HRP 最敏感的底物;ECM结果容易控制,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。

 

11、抗原检测出的分子量比资料上的大,是怎么回事?

答:a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量,煮沸变性时间延长,可以打开二聚体。b)蛋白本身的修饰如:糖基化,磷酸化等。

 

12、蛋白转移不到膜上,但胶上有,同时Marker 转上去了,为什么?

答:可能是:a)样品浓度过低;b)转移时间不够。

 

13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等?

答:NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂,一般最好加。但是不加也可以,大部分时候是不用加的。

 

14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在,需要做免疫组化和western blot试验吗?做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗?

答: 免疫组化可以用来进行定位,但是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是不能定位。

两种实验的一抗有时候不能通用,公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验,在免疫组化时,是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

 

15、做Western Blot时,提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?

答:怀疑是样品问题,可能是:

1,样品不能反复冻融;

2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查Western Blot过程, 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

 

16、细胞水平要做western blot,多少细胞提的蛋白够做western blot

答:一般5×10^6就足够了。

 

17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么?这样对western blot有无影响?

答:能,没有问题。有商品化的试剂盒可以满足。

 

18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?

答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。

 

19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?

答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

 

20、我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?

答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,加20%甲醇。


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