欢迎访问西安昊兴生物科技有限公司网站

返回首页|联系我们

全国统一服务热线:

4000298128
技术文章您当前的位置:首页 > 技术文章 > 干货分享--WB实验问题总结与处理方案(二)

干货分享--WB实验问题总结与处理方案(二)

日期:2021-07-27浏览:556次

Western blot实验过程中常见问题汇总及处理方案。

 

21、想分离的蛋白是分子量200kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?浓缩胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗?

答:分离胶用7%,浓缩胶 3.5%,200kd的蛋白不好做。

 

22、如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?

答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5mm的。

 

23、蛋白变性后可以存放多久?

答:-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)

 

24、我所测定的蛋白分子量是105KD,按理说分离胶应当采用7.5%,但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?

答:上述提到的两种凝胶均可以使用,因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意条带位置。

 

25、二抗是生物素化的抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗?

答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BSA代替应该好一点.

 

26、问一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?

答:Western Blot一般上样30100ug不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。

 

27、做组织样品的western的时候,怎样处理样品?

答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF)。

 

28、问大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?

答:做200kd蛋白的Western Blot时要注意,分离胶最好选择7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。

 

29、有什么方法可以提高上样量?

答:a)可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量;b)5倍的上样缓冲液来稀释变性

 

30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求?

答:上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等,如果只是要定性,则没有太大的关系, 尽量多上就行了, 但是不要超载。

 

31、一抗,二抗的比例是否重要?

答:比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。

 

32、要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?

答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。

 

33、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?

答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。

 

34Western Blot 中抗体的可以重复应用吗?

答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用23次。稀释后应在23天内使用,4度保存,避免反复冻融。

 

35、在做Western Blot时,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

答:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

 

36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗?

答:可以。

 

37、转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好,为什么?

答:这是正常的,大分子的蛋白转移的慢, 你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。

 

38、做Western Blot时,同样的抗体免疫组化能做出,而Western Blot却不能?

答:这多半是抗体的问题,要看抗体的说明,是否能做Western Blot和免疫组化。

 

39、如果是6×8转印膜,要加多少一抗?

答:一抗的稀释度是有说明的,根据你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育体积一般最少为35ml

 

40、上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果。

答:无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。

 


上一篇:干货分享--WB实验问题总结与处理方案(三)

下一篇:干货分享--WB实验问题总结与处理方案(一)

QQ咨询 联系方式 二维码

服务热线

17791407282

扫一扫,关注我们