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干货分享--WB实验问题总结与处理方案(三)

日期:2021-07-27浏览:945次

41、跑电泳的时候配的胶总是“缩"是什么原因呢?是有的成分不对吗?

答:没什么问题,就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了;也可能母液(30%聚丙酰胺)有问题,你可以重新配制一份观察;能够替换的试剂,尽量换一下,选用好的试剂。

 

42、蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗?

答:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd66kd可以一起转,12SDS-PAGE 湿转120mA 45-60min就可以了, 可以根据你实验室的经验调节;170kd 7%SDSPAGE200mA 90-120min

 

43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?

答:可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和PVDF膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的PVDF膜(0.2微米)。

 

44、我用的是可视marker,但是电泳总跑不全8条带,请问什么原因?怎样改善?胶用过8%,10%,12%,都是这样。marker是新买的。

答:一般来说,是小分子量Marker跑走了,增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。

 

45、是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参?

答:半定量实验需要有内参。

 

46、核内抗原Western Blot内参选择什么合适?

答:可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的,有很多都可以当成内参,在网上查查就可以选出你要的内参。

 

47、做半定量Western Blot,内参β-actinGAPDH哪个好?

答:两者均可。

 

48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区别吗?

答:一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法,一般来说都没有区别。

 

49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%TBST脱脂奶粉",其中TBST最后那个TTween吗,浓度多大?

答:是Tween,配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl8g Tris base2.42g 加水 800ml溶解, 500-1000ul Tween-20, HCl 调节pH 7.4, 加水定容至 1L

 

50、封闭,一抗,二抗时的温度有没有什么规定呢,比如在室温里做,或者要在4度下?

答:均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后4度过夜。

 

51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?

答:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合,同时也有疏水作用,但相对较弱。这样的话,PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。

 

52、怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道都能很直,上样的量和灌胶是否很重要,电压有什么要求?

答:影响跑胶跑的质量,有以下几个因素:

1)电压,小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶55v,分离胶75v就能跑得很好。

2)胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶.

 

53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候,小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?

答:小分子的蛋白在转移过程中,会透过膜去,所以大分子的上去以后,有一部分小分子的就透过去了。

 

54.电泳中常出现的一些现象:

●︶ 条带呈笑脸状

原因:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

●︵ 条带呈皱眉状

原因:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全。

●拖尾

原因:样品溶解不好。

●纹理(纵向条纹)

原因:样品中含有不溶性颗粒。

●条带偏斜

原因:电极不平衡或者加样位置偏斜。

●条带两边扩散

原因:加样量过多。

 

55Western blot结果中背景较高

可能的原因及建议:

●膜封闭不够

延长封闭的时间;选择更加适合的封闭液。

●一抗稀释度不适宜

对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度。

●一抗孵育的温度偏高

建议4℃结合过夜。

●选择的膜容易产生高背景

一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。

●膜在实验过程中干过

实验过程中要注意保持膜的湿润。

●检测时曝光时间过长

减少曝光时间。

 

56Western blot结果中杂带较多

可能的原因及建议:

●目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小。

●目的蛋白有其它剪切本

查阅文献或生物信息学分析可能性。

●样本处理过程中目的蛋白发生降解

加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作。

●上样量过高,太敏感

适当减少上样量。

●一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体。

●一抗不纯

纯化抗体

●一抗或者二抗浓度偏高

降低抗体浓度。

 

57 . Western blot结果中无信号或显示信号弱

可能的原因及建议:

●检测样本不表达目的蛋白

选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性。

●检测样本低表达目的蛋白

提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

●转移不完全或过转移

可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。

●抗体不能识别测试种属的相关蛋白

购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

●一抗孵育时间不足

建议4℃结合过夜。

●二抗与一抗不匹配

选择针对一抗来源的种属的抗体。

●洗膜过度

洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20

 

58. 其它现象:

●膜上多处出现黑点或黑斑

原因:抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。

●反白(条带显白色)

原因:目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。

●蛋白分子量偏低或偏高

原因:胶浓度不适合,高分子量要用低浓度胶;小分子蛋白要用高浓度胶。

 

59.安全问题:

操作有毒试剂时,带手套,且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。


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