干货分享--WB实验问题总结与处理方案（三）

41、跑电泳的时候配的胶总是“缩"是什么原因呢？是有的成分不对吗？

答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂。

42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE， 湿转120mA， 45-60min就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。

43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？

答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和PVDF膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的PVDF膜（0.2微米）。

44、我用的是可视marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。

答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。

45、是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？

答：半定量实验需要有内参。

46、核内抗原Western Blot内参选择什么合适？

答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。

47、做半定量Western Blot，内参β-actin，GAPDH哪个好？

答：两者均可。

48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。

49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉"，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？

答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 调节pH 至 7.4, 加水定容至 1L。

50、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下?

答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。

51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

52、怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？

答：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：

（1）电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55v，分离胶75v就能跑得很好。

（2）胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶.

53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?

答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。

54．电泳中常出现的一些现象：

●︶ 条带呈笑脸状

原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

●︵ 条带呈皱眉状

原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不*。

●拖尾

原因：样品溶解不好。

●纹理（纵向条纹）

原因：样品中含有不溶性颗粒。

●条带偏斜

原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。

●条带两边扩散

原因：加样量过多。

55．Western blot结果中背景较高

可能的原因及建议：

●膜封闭不够

延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

●一抗稀释度不适宜

对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

●一抗孵育的温度偏高

建议4℃结合过夜。

●选择的膜容易产生高背景

一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。

●膜在实验过程中干过

实验过程中要注意保持膜的湿润。

●检测时曝光时间过长

减少曝光时间。

56．Western blot结果中杂带较多

可能的原因及建议：

●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

●目的蛋白有其它剪切本

查阅文献或生物信息学分析可能性。

●样本处理过程中目的蛋白发生降解

加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

●上样量过高，太敏感

适当减少上样量。

●一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体。

●一抗不纯

纯化抗体

●一抗或者二抗浓度偏高

降低抗体浓度。

57 . Western blot结果中无信号或显示信号弱

可能的原因及建议：

●检测样本不表达目的蛋白

选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

●检测样本低表达目的蛋白

提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

●转移不*或过转移

可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

●抗体不能识别测试种属的相关蛋白

购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

●一抗孵育时间不足

建议4℃结合过夜。

●二抗与一抗不匹配

选择针对一抗来源的种属的抗体。

●洗膜过度

洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

58. 其它现象：

●膜上多处出现黑点或黑斑

原因：抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。

●反白（条带显白色）

原因：目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。

●蛋白分子量偏低或偏高

原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

59．安全问题：

操作有毒试剂时，带手套，且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。