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重组DNA的构建(载体构建)

日期:2021-07-29浏览:401次

基本原理:
    外源目的DNA与载体分子的连接称为DNA重组,重组的DNA称为重组体或重组子。研究中需要克隆或表达的基因为外源DNA,载体是指能够携带外源基因进入受体细胞,并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的工具,其中质粒载体最为常用。
    质粒是独立于细菌染色体外具有自我复制的DNA分子。所有的质粒都有复制子、选择性标志和多克隆位点3个共同的特性。质粒载体的选择包括载体的大小、载体拷贝数、多接头以及筛选插入片段的能力,pcDNA3.1(+/-)是比较常用的真核表达载体。

基本步骤:
    1、目的DNA片段的获得。这一步骤中,可以选择通过设计引物进行PCR扩增来获得目的DNA片段,也可以通过化学合成的方法来获得目的DNA片段,这里值得注意的点,目的DNA片段5'和3'端需要引物合适的酶切位点,方便后续与质粒载体的连接。
    2、目的DNA片段与质粒连接。通过选择的酶切位点将环形的质粒酶切成线性,与目的DNA片段进行连接反应,而后转化至大肠杆菌感受态细胞中,进行培养。
    3、连接产物转化及鉴定。挑选2-3个单克隆置于含有抗性的液体
培养基中进行扩大培养。提取质粒进行双酶切鉴定,双酶切后电泳,能够看到存在与目的DNA片段大小一致的条带,说明此单克隆插入了目的DNA片段,而至于目的DNA片段中碱基序列是否存在突变点,需进行一代测序验证。只有同时满足双酶切鉴定大小合适并且测序后DNA碱基序列完全一致的单克隆菌才被认定为构建成功的重组子。
    4、鉴定正确的重组质粒扩大培养及保种。将上述构建成功的重组子质粒菌种再一次扩大培养,提取重组子质粒以及进行保种,方便后续实验使用。
    值此,包含此外源DNA的重组DNA的构建算全部完成。

注意事项及心得体会:
    1、目的DNA片段获取过程中,如果选择通过设计引物进行PCR扩增方法来获得,建议选择高保真的酶来进行扩增反应,这样在一定程度上可以降低因为扩增反应而产生的碱基引入错误。
    2、PCR产物和酶切产物尽量不要放置时间过长,最好是即时进行连接。
    3、连接体系中载体与目的基因的分子数比例,需要摸索合适的比例,一般为1:3--1:10,合适的比例能够提高连接效率。
  

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