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RNA免疫共沉淀技术

日期:2021-08-12浏览:284次

        RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP )是一种基于抗体的技术,用于定位体内的RNA-蛋白质相互作用。将所关注的RNA结合蛋白(RBP)与其结合的RNA一起进行免疫沉淀,鉴定结合转录RNA(mRNA、非编码 RNA或病毒RNA),可以通过实时PCR、微阵列或测序检测。表观遗传学和RNA生物学领域对不同RNA作用和功能的关注大大增加。据观察,RNA的功能远不止转录和后续的翻译。例如,RNA-蛋白质相互作用能够调控mRNA和非编码RNA的功能。对RNA潜能的这一新认识带动了新方法的发展,使研究人员能够定位 RNA-蛋白质相互作用。RIP是一种研究单个蛋白质和 RNA 分子间物理结合的实验方案。

       

实验步骤:

1.裂解组织/细胞(使用甲醛选择性处理细胞,体内交联蛋白质-RNA 复合物)。

2.分离细胞核,裂解细胞核沉淀。

3.染色质片段化。

4.将所关注的 RNA 结合蛋白 (RBP) 和结合的 RNA 一起进行免疫沉淀。

5.洗去未结合的物质,纯化免疫沉淀后 RBP 上结合的 RNA。

6.RNA鉴定,通过 qPCR、微阵列或测序进行。

7.结果判读。RIP实验通常分为三组:Input组,IgG组和目的蛋白组。分析RIP实验结果,即检测目的蛋白能够结合的RNA含量,IgG组作为背景RNA含量的参照。结果分析方法为:将目的蛋白组中结合的RNA检测值与IgG组结合的RNA检测值相比,作为目的蛋白结合RNA的相对值。我们认为,比IgG组结合量多的即为阳性结合,与IgG组结合量无差异或结合量少的即为不结合。

注意事项:

1.在裂解细胞的时候,瞬时冻融能够使裂解更加充分,但是多次反复冻融则会导致蛋白质和RNA的裂解。

2.实验分组中,IgG组用来作为衡量RNA非特异结合背景含量的参考,而选择IgG时应注意亚型要与目的蛋白抗体的亚型完全一致。抗体包裹Protein-A/G时,使用的IgG浓度必须与目的蛋白抗体含量完全一致。

3.在Protein-A/G清洗步骤中,充分彻底的洗涤非常重要,因此加入适量的尿素、SDS以提升实验的严谨性。

4.实验操作过程应在冰上进行,以防止蛋白质和RNA的降解。RNase-free的耗材的使用是需要的,避免RNA的降解。

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