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质粒提取窍门

日期:2021-08-12浏览:688次

       提取质粒DNA的方法有很多种,从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取,从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取,从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法等,各种不同的方法各有其优缺点,根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。

碱裂解法:

       使用碱与SDS裂解法从E. coli(大肠杆菌)中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,将质粒DNA释放到上清中。碱性溶剂使碱基配对完全破坏,闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离,这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过,当pH值恢复到中性时,DNA双链就会再次形成。在裂解过程中,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时,复合物会从溶液中有效地沉淀下来,离心除去变性剂后,就可以从上清中回收复性的质粒DNA。在SDS存在的条件下,碱水解是一项非常灵活的技术,它对E. coli的所有菌株都适用,并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。

       质粒小提试剂盒,它结合了优化的碱裂解法,以及方便快捷的硅膜离心技术,具有高效,快捷的特点,能在30min内完成全部操作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA(OD260/OD280=1.7-1.9),此质粒DNA可直接用于DNA序列分析,各种酶促反应,PCR以及部分细胞系的转染等。

煮沸法:

        煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中,然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁,还有助于解开DNA链的碱基配对,并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离,这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后,闭环DNA的碱基又各就各位,形成超螺旋分子,离心除去变性的染色体DNA和蛋白质,就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效,可用于提取少至lmL(小量制备),多至250mL(大量制备)菌液的质粒,并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株,则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去,会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大,在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株(其中包括TGl)能产生大量的碳水化合物,不适于用煮沸法裂解。


抽提窍门及注意事项:

1、加裂解液后,操作一定要温和,剧烈混合会导致基因组DNA污染。

2、洗脱时60℃温育(Ellution Buffer)洗脱缓冲液或去离子水效果更好。

3、若质粒提取含量低,可增加菌液样或换用ArtMedia Plasmid Culture,其比LB培养基质粒得量高。

4、菌体应彻底悬浮 , 如果没有彻底悬浮菌体,则残留的菌体团块在溶液 II 加入后,变成难以完全裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后,会有一部分蛋白质继续存在于溶液中,成为蛋白质残留的最大根源。

5、加入溶液 II 后,混匀,体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了,马上加入溶液 III 中和。

6、中和的操作 ,在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后,先颠倒两次,使管底朝上,用指头弹击管底数次,再颠倒混匀。效果非常好。


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